Ahli biologi molekular telah menemukan sesuatu yang mengejutkan dalam beberapa tahun terakhir: beberapa reagen terpenting mereka sangat tidak dapat diprediksi sehingga sejumlah besar penelitian terkini mungkin tidak akurat. Antibodi, keluarga protein yang telah digunakan para ilmuwan selama beberapa dekade untuk segala hal mulai dari mengukur ekspresi reseptor hingga menyaring produk gen penting, merupakan inti dari masalah ini.
Anda dapat menggunakan kata “validasi” di berbagai bidang, dan ada banyak makna yang sering kali saling bertentangan. Di sini, validasi adalah bukti empiris dan dokumentasi bahwa suatu antibodi sesuai untuk aplikasi atau tujuan yang dimaksudkan. Akibatnya, validasi berlaku untuk zat (bio)kimia dalam konteks suatu prosedur atau proses.
Jadi, apa saja kesulitan yang dihadapi para ilmuwan atau peneliti saat memvalidasi antibodi? Apakah ada cara efektif untuk mengatasi masalah berat ini? Baca terus untuk mengetahui tantangan paling mendasar dan solusinya dalam validasi antibodi.
Apa saja kendala utama dan jawabannya terhadap validasi antibodi?
Antibodi merupakan salah satu reagen yang paling sering digunakan dalam sains, pengujian klinis, dan diagnostik. Meskipun penggunaannya meluas dan memerlukan upaya serta komitmen finansial yang signifikan, kelebihannya tidak memerlukan standar baku untuk validasi antibodi sebelum digunakan. Berikut ini adalah beberapa masalah penting yang menghambat validasi antibodi:
- Klasifikasi Tujuan:
Kemampuan antibodi untuk menempel secara khusus pada molekul lain, yang disebut antigen, yang biasanya berupa analit, mungkin merupakan aspek yang paling menonjol. Jika spesifisitas kelompok tidak tersedia, antigen harus dapat ditentukan sebagaimana mestinya, bukan kumpulan generik molekul serupa.
Tidak mungkin untuk menentukan apakah perekat cukup selektif jika targetnya tidak ditentukan secara memadai. Kebingungan sering terjadi jika dibandingkan dengan teknik lain, mungkin non-imunokimia, dan jika Anda tidak dapat menunjukkan adanya hubungan.
- Reaksi Silang (CR):
Ini adalah karakter rumit yang sering disalahpahami oleh para peneliti. Banyak penelitian secara implisit menggunakan konsep di mana proporsi dua konsentrasi penghambatan 50 persen berfungsi. Karena nilai IC50 dikaitkan dengan standar afinitas kombinasi antibodi/antigen, CR dapat dianggap sebagai konstanta afinitas yang dekat jika dihitung berdasarkan molar.
Spektrometri molekuler resolusi tinggi merupakan pilihan yang tepat untuk menyelidiki puncak-puncak yang tidak terduga guna menemukan reaktan silang yang tidak diketahui. Dibandingkan dengan metode “kelompok zat”, teknik ini menawarkan keuntungan yang signifikan: reaktan silang yang tidak terkait secara struktural mudah diidentifikasi. Imunopresipitasi yang disertai dengan teknik analisis merupakan pendekatan menarik lainnya.
Semakin banyak data CR untuk antigen atau immunoassay yang dapat diakses, semakin Anda dapat mengevaluasi kegunaannya dalam pengaturan aplikasi tertentu. Secara umum, semakin banyak data CR menunjukkan bahwa antibodi telah dideskripsikan dengan baik.
- Konsentrasi antibodi:
Konsentrasi antibodi sulit diukur, misalnya, menggunakan resonansi plasmon permukaan (SPR). Banyak perusahaan malah menggunakan teknik nonselektif, seperti UV pada 280 nm, uji skrining Bradford, asam bicinchoninic, atau analisis asam amino47 (yang mencakup pengotor seperti albumin dan imunoglobulin G [IgG] yang bergeser), atau EL I SA , yang masih melibatkan beberapa IgG yang tidak terkait.
Lebih jauh, Anda harus memperhatikan bahwa bahan kimia penstabil mungkin telah ditambahkan ke reagen secara sengaja. Bovine serum albumin, seperti Tris, sangat penting. Senyawa yang mengandung amino ini dapat mempersulit konjugasi atau pelabelan antibodi. Harus ditentukan dalam protokol jenis penentuan saturasi yang digunakan dan bahan pengawet apa yang disertakan dalam produk.
Formulasi antibodi yang dioptimalkan diperlukan untuk sebagian besar aplikasi praktis. Sinyal lemah dihasilkan dari konsentrasi rendah, sedangkan interaksi nonspesifik dihasilkan dari jumlah besar. Akibatnya, konsentrasi antibodi aktif dalam sediaan kimia harus ditetapkan.
- Dokumentasi yang tepat dan akurat:
Anda harus mencatat semua informasi tentang unsur-unsur di atas dalam lembar data dengan saksama. Indikator signifikan validasi antibodi yang tidak memadai adalah brosur yang hampir kosong dan hanya mencantumkan nama larutan dan nomor pesanan. Antibodi seperti ini dapat membantu dalam situasi saat penyaringan pengikat merupakan pekerjaan penting. Namun, jika reagen yang dapat diandalkan diperlukan, Anda harus menghindari barang-barang tersebut.
Reagen yang tidak terdokumentasi dengan baik dapat mengakibatkan pemborosan tenaga dan sumber daya. Sering kali lebih baik untuk membuat antibodi yang terdokumentasi dengan baik daripada mengutak-atik produk yang informasinya sedikit tersedia dan yang pada akhirnya tidak sesuai.
- Penyimpanan dan stabilisasi:
Namun, antibodi adalah reagen yang tidak stabil dan memerlukan perhatian khusus. Akibatnya, tidak semua metode stabilisasi dan penyimpanan antibodi berlaku untuk semua antibodi. Jika Anda menggunakan antibodi untuk jangka waktu yang lebih lama, ada baiknya untuk memvalidasi stabilitasnya dalam keadaan tertentu.
Karena banyak zat kimia antibodi yang mahal, stabilitas yang buruk dapat mengakibatkan beban keuangan yang besar dan ketidakpuasan. Informasi tentang kondisi penyimpanan antibodi tertentu merupakan indikator kuat dari penilaian yang kompeten dan jaminan kualitas.
Sebagai kesimpulan
Anda dapat menggunakan banyak prinsip dasar untuk mengevaluasi validasi antibodi agar sesederhana mungkin, terutama bagi mereka yang baru pertama kali menggunakan antibodi. Banyak teknik baru yang berasal dari antibodi terapeutik, yang telah berkembang dalam kepentingan ekonomi dalam beberapa tahun terakhir. Daftar periksa ini akan membantu meningkatkan kualitas keseluruhan penggunaan antibodi diagnostik atau analitik.
